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776 安全第一（第1页）

远隔效应是指放射治疗（RT）期间或之后放射野外肿瘤的消退，已在各种癌症中报道，例如黑色素瘤、肾细胞癌和乳腺癌。虽然其机制尚未完全阐明，但远隔效应可能是由辐射诱导的全身免疫反应增强介导的。然而，很少观察到远隔效应，可能是因为癌细胞的免疫逃逸机制，包括免疫检查点通路的激活。在过去十年中，新开发的免疫检查点抑制剂（ICI）彻底改变了癌症治疗。随着可增强针对癌细胞的全身免疫反应的ICI的出现，结合ICI和放疗的新治疗方案有望增强远隔效应。正在积极研究ICI和RT的协同效应，并且在各种报告中都研究了这种组合增强远隔效应的潜力。

肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，也是世界范围内癌症相关死亡的第二大原因。早期HCC患者接受切除、肝移植和消融等治疗方式的总生存率>60%，而接受化疗栓塞或全身治疗的晚期HCC患者预后不佳。为了改善这种不良结果，最近在HCC治疗中加入并建议了新方案，包括考虑使用ICI。因此，各种ICIs，包括程序性细胞死亡1（PD-1）抑制剂、PD配体1（PD-l1）抑制剂和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（CTLA-4）抑制剂，在HCC患者中的可行性和安全性正在研究中。然而，报道的ICIs的客观缓解率（orr）仅为15-20%，仍不令人满意。此外，最近评估派姆单抗治疗晚期HCC患者疗效和安全性的KEYNOTE-240试验未能显示与安慰剂相比在总生存期和无进展生存期的改善方面具有统计学意义。由于其免疫原性引起的远隔现象，RT在用于提高ICI对晚期HCC的疗效方面受到了相当大的关注。

最近在一些临床前实验和临床试验中检测了协同治疗在控制原发性HCC中的功效。然而，这些先前的研究没有使用转移性HCC模型，而是使用原位模型，这只能观察RT和ICI对原发肿瘤的联合作用，而不是远隔效应。因此，在本研究中，我们旨在使用双侧小鼠同源HCC模型研究辐射对远隔现象的作用和免疫学机制，以及抗PD-1抗体对远隔效应的影响。

使用Hepa1-6细胞建立同系双侧HCC小鼠模型（图1A）。肿瘤生长曲线显示，与未照射的肿瘤相比，使用总剂量16Gy分两次照射而不是在单次使用8Gy更显着地抑制照射肿瘤生长（P<0.001，图1B）和未照射的肿瘤生长（P<0.05，图1C）。对第31天收获的肿瘤进行拍照（图1D），与单次8Gy照射相比，分两次总剂量16Gy照射显着提高小鼠的存活率（P<0.001，图1E）。表明在目前的HCC模型中总剂量16Gy分两次照射方案适用诱发远隔效应。

为了确定局部照射降低未照射肿瘤大小是否与免疫原性激活有关，我们对肿瘤浸润淋巴细胞进行了流式细胞术分析（图2A，B）。数据表明，，而不是单次8Gy显着增加了CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+T细胞在照射肿瘤（P<0.001和P<0.05，图2C）和未照射的肿瘤（P<0.001和P<0.001，图2D）的浸润。此外，总剂量16Gy分两次照射还增加了受照射肿瘤中调节性T细胞（Treg、CD4+CD25+Foxp3+）的浸润（P<0.05，图2C）。

为了了解局部照射如何缩小未照射的肿瘤，我们使用流式细胞术检测了小鼠右后腿的肿瘤引流的腹股沟淋巴结中的DCs（图3A、B）。数据显示，总剂量16Gy分两次照射显着增加了TDLN中活化DCs比例，这由CD40（P<0.001）和CD80（P<0.01，图3C）的高表达所证明。TDLN中CD11c+DC上的共抑制分子PD-L1的表达也由总剂量16Gy分两次照射诱导（P<0.05，图3C）。此外，总剂量16Gy分两次照射显著增加了CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+T细胞（P<0.001，图3D），激活了TDLN中的T细胞。Tregs在TDLN中的积累在总剂量16Gy分两次照射组中也比单个8Gy照射组更明显（图3D）。

基于显示辐射增加TDLNDC中PD-L1表达的结果，我们确定了PD-1PD-L1通路的阻断是否可以进一步增强同源双侧HCC小鼠的远隔效应模型（图4A）。抗PD-1抗体比同型IgG对照更能抑制双侧Hepa16肿瘤的生长，但差异无统计学意义。总剂量16Gy分两次照射抑制了受辐照（P<0.001）和未受辐照的远侧肿瘤（不显着）的生长。与单独放疗或抗PD-1单药治疗相比，放疗和抗PD-1联合治疗进一步抑制了受辐射和未受辐射肿瘤的生长。用抗PD-1抗体和辐射联合治疗的小鼠肿瘤明显小于用辐射或抗PD-1单一疗法治疗的小鼠的肿瘤（图4D）。单独的抗PD-1治疗并没有提高生存率，但与放疗相结合，它显着提高了生存率（P<0.001）。

使用CD4和CD8特异性抗体的免疫组织化学显示，与IgG对照相比，单独的抗PD-1抗体和放疗更显着地增加了CD4+和CD8+细胞在照射肿瘤中的浸润（P<0.05），CD4+细胞向未放疗的对侧肿瘤的浸润（P<0.01和P<0.001；补充图2C，D）。用抗PD-1抗体和辐射联合治疗进一步增强了CD8+细胞向两种肿瘤的浸润，尽管没有明显的累加效应。

对第31天收获的肿瘤进行流式细胞术分析（图5A）表明，在受照射的肿瘤中，总剂量16Gy分两次照射，而不是抗PD-1抗体治疗更显着增加CD4+和CD4+IFN-γ+T细胞的浸润（P<0.001，）。类似地，总剂量16Gy分两次照射增加了总CD8+和CD8+IFN-γ+T细胞的浸润。与单独使用抗PD1抗体而不是单独使用辐射相比，用抗PD-1抗体和辐射联合治疗进一步增强了CD4+和CD8+T细胞的浸润。放疗和抗PD-1抗体均增加了未受照射肿瘤中的CD4+和CD4+IFN-γ+T细胞，但不增加CD8+T细胞，而它们的联合治疗增加了总CD8+和CD8+IFN-γ+T细胞超过任何一种单独治疗。与IgG对照治疗相比，放射和抗PD-1抗体的组合增加了两侧肿瘤中CD25+CD4+Foxp3+Tregs的浸润（P<0.05和P<0.01），而在各组之间没有观察到CD11c+DCs的差异。

流式细胞术免疫表型分析显示，CD220+B细胞、F480+巨噬细胞、Ly6******11b+中性粒细胞、Ly6****11b+Ly6C+单核骨髓源性抑制细胞（MDSCs）和Ly6****11b+Ly6Clow粒细胞-MDSCs的数量不受单一疗法或联合疗法的影响，除了CD3+T细胞。

远隔效应是一种由辐射引起的罕见现象，可以通过免疫疗法得到加强。尽管放射疗法和免疫疗法越来越多地用于治疗肝细胞癌（HCC），但免疫疗法是否可以增强远隔效应仍不清楚。在这项研究中，旨在阐明在鼠HCC模型中由辐射和免疫治疗相结合引起的远隔效应的免疫学机制。通过将小鼠Hepa1-6HCC细胞接种到具有免疫活性的C57BL6小鼠的两条后腿上，建立同源HCC小鼠模型。右后腿的肿瘤被照射，在左后腿未照射的肿瘤中观察到远隔效应，有或没有抗程序性细胞死亡1（PD-1）抗体的共同给药。进行流式细胞术分析以分析浸润受照射和未受照射的肿瘤以及肿瘤引流淋巴结（TDLN）的免疫细胞的分布。与单次8Gy照射相比，两次共16Gy照射更有效地抑制了受辐射和未受辐射的肿瘤的生长，细胞毒性T细胞的肿瘤浸润更高。更高的剂量还增加了TDLN中活化的树突细胞，其具有更高的程序性细胞死亡配体1的表达。抗PD-1抗体的共同给药显着增强了远隔效应，并增加了受照射和非照射的活化细胞毒性T细胞的浸润。受辐射的肿瘤。的研究结果表明，在放疗中加入抗PD-1疗法可增强HCC同源小鼠模型的远隔效应。

红细胞的生成是一个被严格调控的过程。在稳态的血细胞生成过程中，骨髓每小时大约产生1010个红细胞，以使血红蛋白水平维持在一个很窄的范围内。在持续失血或溶血的情况下，红细胞的生成可快速增加。

骨髓的红系祖细胞是定向分化的单系祖细胞，从有双向或多向分化潜能的祖细胞（源自一群数量极少的造血干细胞）随机分化而来的。

有两种红系祖细胞[爆式红系集落形成单位（erythroidburst-formingunit，BFU-E）和红系集落形成单位（erythroidcolony-formingunit，CFU-E）]不能通过特定的形态学特征予以识别，但能采用流式细胞技术予以纯化和分析。有证据显示所有造血祖细胞或干细胞与淋巴母细胞相似。

1、局部照射减少小鼠脾脏中肿瘤引起的Ter细胞聚集

前期发现肿瘤诱导红细胞祖细胞（EPCs）的产生与不良预后显著相关，而靶向EPC或其产物可抑制肿瘤的进展。

LCC荷瘤小鼠脾肿大，放疗后基本恢复正常大小。Ter119+CD71+EPCs放疗后，其比例也明显恢复到基线水平。此外，在MC38、B16-SIY荷瘤模型中，也观察到了放疗后Ter细胞显著减少的现象，表明放疗诱导的Ter细胞减少并不局限于某种肿瘤类型。

2、IFNs与T细胞是辐射影响Ter细胞所必须的

?文献报道放疗可通过I型干扰素和T细胞触发局部和全身抗肿瘤免疫，为了确定I型IFN在放疗介导Ter细胞减少中的作用。采用IFNAR-KO小鼠，发现放疗可使WT小鼠脾脏减小、脾细胞数量减少、Ter细胞数量减少，但IFNAR-KO小鼠中该现象消失。还对比了局部照射或外源性注射干扰素治疗WT小鼠肿瘤的效果，发现两者均可减少Ter细胞数量。这表明I型干扰素信号途径对于放疗介导的Ter细胞减少是必需的。

?鉴于T细胞在放疗抗肿瘤中具有一定作用，研究人员探索了T细胞在放疗介导Ter细胞减少中的作用。采用免疫缺陷小鼠模型RAG-KO，发现RAG-KO小鼠放疗后Ter细胞并未减少，表明放疗诱导Ter细胞减少依赖于T细胞。

?为探索是CD4或CD8亚群T细胞在其中发挥作用，采用抗体清除CD4+或CD8+T细胞后，发现清除CD8+T细胞后，放疗诱导的Ter细胞减少作用消失，表明是CD8+而非CD4+T细胞发挥作用。

3、通过阻断PD-L1可减少肿瘤诱导的依赖于CD8+T细胞和IFNγ的Ter细胞聚集

?PD-L1抑制剂能够增强CD8+T细胞的功能。PD-L1抑制剂能否逆转脾脏Ter细胞积累？对荷瘤小鼠腹腔注射PD-L1抗体或进行放疗，发现PD-L1抗体或放疗均抑制脾肿大和减少脾细胞，降低脾脏Ter细胞的比例和数量。

?PD-L1抗体还减少脾脏中ARTN的表达，降低血清中ARTN的浓度。因此，PD-L1抗体可降低肿瘤诱导的Ter细胞积累和ARTN的产生，且其作用依赖于CD8+T细胞和IFN。

4、Ter细胞和ARTN破坏放疗或IO的疗效

?体外试验发现肿瘤细胞与Ter细胞共培养，或肿瘤细胞培养中外源加入ARTN，均可增强小鼠肿瘤细胞的抗辐射能力。而Ter细胞和ARTN会使CD8+T细胞的细胞毒作用减弱。

?在体内模型中，通过过继性转移Ter细胞或外源性注射ARTN减弱放疗和PD-L1抗体抗肿瘤作用。表明免疫治疗和放疗的治疗作用部分依赖于它们对Ter细胞的抑制。

5、破坏Ter细胞-ARTN轴可以促进放疗或IO的疗效

?破坏TerARTN轴能够提高放疗和PD-L1抗体的疗效。anti-Ter119抗体耗竭小鼠Ter细胞后放疗和PD-L1抗体的作用提高，阻断ARTN也能增强疗效。

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6、放疗和IO应答患者显示出治疗导致的Ter细胞减少

?发现在接受放化疗的NSCLC患者中，治疗后没有复发的患者治疗后血液中ARTN浓度显著降低，但治疗后复发患者的血液中ARTN浓度无显著变化。

一项临床试验发现患者接受放疗后进行免疫治疗，放疗后完全或部分缓解患者的Ter细胞丰度显著下降，肿瘤进展（或对治疗无反应）的患者中，Ter细胞丰度无显著变化。表明患者对于放疗和免疫治疗的响应与其Ter细胞数量以及ARTN浓度相关。

?研究小结?

放疗和PD-L1阻断治疗能够降低肿瘤诱导产生的Ter细胞和ARTN水平，机制层面，放疗和PD-L1阻断治疗可使体内发生由干扰素、DCs和CD8+T细胞介导的先天和适应性免疫应答，这些应答也是治疗充分发挥疗效所必需的，同时，阻断Ter细胞-ARTN轴可以促进放疗和抗PD-L1治疗的效果。

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